Journal of Molecular Virology and Immunology
Yazarlar: Kemal TEKİN, Mustafa KOCAMAN
Konular:-
DOI:10.46683/jmvi.2020.8
Anahtar Kelimeler:Kolaylaştırıcı,İnhibitör,Amplifikasyon,Optimizasyon.
Özet: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) temelli testler günümüzde enfeksiyon hastalıklarının tanı ve izleminde en sık kullanılan moleküler yöntemlerdir. PCR’ın farklı amaçlar için tasarlanmış nested PCR, ters transkripsiyon PCR, multipleks PCR, real-time PCR ve kantitatif PCR gibi çok sayıda farklı modifikasyonu geliştirilmiştir. Real-time PCR’ın bile birbirinden farklı görüntüleme yöntemleri ve prob tasarımlarının kullanıldığı çok sayıda alt tipi vardır. PCR yöntemi bu modifikasyonları dışında yeni nesil dizi analizi, DNA çip teknolojisi, ters hibridizasyon teknikleri, klonlama çalışmaları, lumineks teknolojisi, PCR-ELISA ve PCR-RFLP gibi temel moleküler tekniklerin bir parçası veya ön basamağı olarak da yaygın kullanım alanı bulmuştur. Bu önemli teknik çevresel, klinik, fosil, adli tıp, gıda, bitki, su ve in-vitro ortam örneklerinde başlıca DNA veya RNA varlığını saptamayı ve analiz etmeyi hedefler. Bu örneklerin bazıları PCR üzerine değişen derecelerde inhibitör etkiler gösteren çok sayıda kompleks biyolojik molekül içeren karışımlardır. Bu heterojen karışımlar içerisinde bulunan inhibitör maddelerin ve ayrıca DNA ve RNA yapısını bozabilen enzimlerin uzaklaştırılması önemlidir. Nükleik asit eldesi için bazı durumlarda hücre duvarı yapılarını parçalamak veya bu moleküllere bağlı proteinleri uzaklaştırmak gerekirken, tüm işlemleri DNA ve RNA bütünlüğünü bozmadan yapmak önemlidir. Yetersiz nükleik asit ekstraksiyonu veya inhibitör maddelerin varlığı özellikle az sayıda hedef nükleik asit içeren örneklerde yanlış negatif sonuçlara neden olabilen önemli bir problemdir. Günümüzde DNA ve RNA eldesi için çok sayıda farklı ekstraksiyon ve saflaştırma yöntemi tanımlanmış ve bu yöntemlerin farklı kombinasyonları otomatize sistemlere entegre edilmiştir. PCR reaksiyonunun verimliliğini artırmanın alternatif bir yolu ise reaksiyon karışımına amplifikasyon kolaylaştırıcıları veya PCR güçlendiricileri olarak adlandırılan stabilizatör katkıların eklenmesidir. PCR temelli yeni bir protokol tasarlanırken veya yeni geliştirilen PCR temelli bir teknikte farklı moleküller kullanılırken ortaya çıkabilecek bilinmeyen yeni inhibitör etkileri izleyerek PCR öncesi koşulların ve amplifikasyon sürecinin optimize edilmesi önem arz etmektedir. Bu makalede her biri farklı avantaj ve dezavantajlara sahip PCR öncesi hazırlık işlemlerinin ve yaygın kullanılan amplifikasyon kolaylaştırıcılarının genel özelliklerinin bir özeti sunulmuştur.